研究进展

2型糖尿病模型db/db小鼠胰岛B细胞超微结构观察

2型糖尿病模型db/db小鼠胰岛B细胞超微结构观察
【摘要】  目的:观察2型糖尿病动物模型-C57BL/KsJ(db/db)小鼠的胰岛B细胞超微结构变化,探讨B细胞的病理改变在2型糖尿病发病中的作用。方法:分别选取3月、5月和8月龄尾静脉空腹血糖高于11.1 mmol/L,且肥胖的db/db自发性糖尿病小鼠,每组5只作为糖尿病组;选取相应年龄段尾静脉空腹血糖低于6.0 mmol/L,体重正常的db/+m表型正常小鼠,每组5只作为对照组。于相应年龄段取胰尾,透射电镜观察胰岛B细胞超微结构。结果:B细胞胞浆内的分泌颗粒数量明显减少,有的细胞甚至缺如,致密芯电子密度降低;线粒体数量减少,肿胀变形,粗面内质网不同程度扩张脱颗粒;细胞核不规则,染色质边集浓染;细胞间髓样小体增多,其严重程度随病情进展逐渐加重。结论:2型糖尿病动物模型db/db小鼠胰岛B细胞存在超微结构的病理改变,严重程度与病情的轻重有关,B细胞功能上的缺陷可能是2型糖尿病的一个重要因素。
【关键词】  糖尿病;2型;B细胞;超微结构;胰岛
  Abstract  Objective:To investigate the ultrastructural changes of the pancreatic islet B-cells of db/db diabetic mice.Methods:The test group selected 3,5 and 8 month-old db/db mice.The age-matched db/+m mice were as the control group. Every group included 5 mice.The pancreatic islet B-cells were observed under transmission electron microscope.Results:Insular B-cell structure of db/db mouse was becoming worse and worse as the disease developed.Numbers of secretory granule in B-cell cytoplasm were significantly decreasing or absent,and  the electron-density of dense core in the secretory granule decreased as well. Mitochondria numbers were decreasing and its volume was swollen. Rough endoplasmic reticulum was swollen,too. Cell nucleus was irregular. Chromatin was marginal and condensing. Myelin-bodies between insular cells were increasing. Conclusion:The study confirms that the pancreatic islet B-cells show ultrastructural changes in db/db diabetic mice,and ultrastructural change of B-cells is related to the degree of diabetes mellitus.
   
  Key words  Diabetes mellitus;Type 2;Beta cells;Ultrastructure;pancreatic islet
  糖尿病是严重威胁人类健康的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,而2型糖尿病(T2DM)又占本病的95%,其发病机制多认为是由胰岛素抵抗和B细胞功能缺陷引起。B细胞功能缺陷是2型糖尿病的不可缺少的重要因素。有关B细胞功能缺陷的研究,多集中在B细胞增殖、再生和死亡引起其数量动态变化方面及各种功能指数,如胰岛素释放实验、稳态模型、高血糖钳夹技术等评价B细胞功能方面[1]。而有关2型糖尿病自然病程中B细胞形态学研究的报道少见。本研究以遗传性肥胖型2型糖尿病动物模型C57BL/KsJ(db/db)小鼠为研究对象,观察了小鼠发病期间的B细胞超微结构变化,探讨B细胞的病理改变在T2DM发病中的作用,为糖尿病的治疗和发病机制提供形态学基础。
  材料和方法
  1.1  动物与分组
         
  实验动物由河北医科大学组织胚胎学教研室提供。糖尿病组:分别选取3月、5月和8月龄db/db自发性糖尿病小鼠,每组5只,尾静脉空腹血糖高于11.1 mmol/L,且肥胖。对照组:选取相应年龄段db/+m表型正常小鼠,每组5只,尾静脉空腹血糖低于6.0 mmol/L,体重正常。
  1.2  方法
         
  每月测空腹血糖1次,称体重1次,于相应月龄,2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,Karnovsky''s固定液灌注固定,开腹取胰尾组织,切成约1 mm3 的小块,浸入Karnovsky''s液中固定,1%四氧化锇后固定,梯度酒精逐级脱水,Epon 812包埋,半薄切片,于光镜下找到胰岛后,莱卡UCT超薄切片机切片,切片厚50 nm,切片用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,日立H-7500型透射电子显微镜观察并摄片。
  结果
  2.1  正常组B细胞电镜观察
         
  B细胞胞浆内有大量的分泌颗粒,为圆球形,较大,外包以界膜,颗粒内有电子密度不一的芯,芯多为圆形,少数可见矩形或不规则的芯,界膜与芯之间的间隙较大,明亮,清晰。胞浆内线粒体、粗面内质网和高尔基复合体丰富而发达。细胞核较大,呈圆形或卵圆形,核膜光滑。
  2.2  糖尿病组B细胞电镜观察
         
  B细胞结构呈渐进形变化,随着血糖的增高,B细胞结构受损加重(图2~图5)。3月龄时,B细胞结构与正常相似,胞浆中分泌颗粒形态改变不大,数量略减少。5月和8月龄时,形态结构变化明显:胞浆中分泌颗粒明显减少,有的细胞甚至缺如,致密芯密度明显减低;线粒体数量减少,肿胀变形,内质网不同程度扩张,可见脱颗粒现象;胞核小而不规则,核膜凹凸不平,染色质浓染边集;细胞间髓样小体增多。
  讨论
        
  2型糖尿病(T2DM)是一种异质性疾病,发病过程是由正常糖调节(NGR)、糖调节异常(IGR),和糖尿病(DM)三个阶段组成,其中IGR又包括空腹血糖损害(IFG)和糖耐量损害(IGT)。其发病机制尚未完全阐明,多认为由胰岛素抵抗(IR)及胰岛素分泌缺陷引起,一般认为IR普遍存在,但多数人并不发生DM,DM易感者在发病前许多年IR已存在(并在IGR阶段或DM早期发展到高峰,然后维持不变),但糖代谢正常。这些人常有肥胖伴高胰岛素(Ins)血症,说明胰岛功能增强,以代偿IR所造成的Ins相对缺乏。理论上无论胰岛素抵抗多么严重,只要B细胞能够分泌足够的胰岛素,就不会发生糖尿病。现在认为,从NGR向IGR转化的主要因素为B细胞功能减低加上IR,而由IGR向DM转化的主要因素为B细胞功能进一步降低。因此,只有当胰岛B细胞失代偿才会引起IGR并发展为DM,这种失代偿来源于B细胞结构改变引起的分泌功能异常及B细胞总量的减少[2~4]。
C57BL/KsJ(db/db)小鼠是一种遗传性肥胖型2型糖尿病动物模型,具有高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗等特征,生后4 W~6 W逐渐出现血糖升高并合并肥胖,是研究2型糖尿病的良好动物模型。本研究观察了3月、5月和8月龄的db/db小鼠胰岛B细胞的超微结构变化,发现B细胞胞浆内的分泌颗粒数量明显减少,有的细胞甚至缺如,致密芯电子密度降低;同时可见线粒体数量减少,肿胀变形,内质网不同程度扩张,脱颗粒;胞核小而不规则,染色质边集浓染;细胞间髓样小体增多,严重程度随病情的进展逐渐加重。表明随着糖尿病进展,B细胞结构破坏加重,分泌颗粒减少,引起其功能缺陷,合成和分泌胰岛素质量下降;其结构的破坏也造成B细胞凋亡增加,进一步加重了胰岛素分泌量的减少,B细胞失代偿,引发糖尿病。造成B细胞功能缺陷的机制至今不清,推测有几个方面原因:其一是B细胞结构本身存在缺陷。其二是高血糖和高血脂对B细胞的毒性作用。研究表明,持续高血糖对B细胞有毒性作用,其机制可能为[1,5,6]:①抑制B细胞的葡萄糖转运蛋白-2(GLUT2)基因表达,使细胞膜上GLUT2数目减少,而使血中葡萄糖主动转运入细胞内受阻。②高血糖使B细胞膜上KATP关闭发生障碍而直接影响胰岛素分泌。③长期高血糖使B细胞内葡萄糖代谢障碍,葡萄糖激酶活性降低,直接影响ATP产生。④高血糖可直接抑制Ins基因的表达,使Ins生物合成量降低。⑤高血糖可使B细胞凋亡增加。这些因素引起B细胞结构破坏,导致B细胞功能缺陷。有研究表明,高游离脂肪酸(FFA)一方面通过抑制葡萄糖外周利用、促进糖异生及引起高胰岛素血症而产生IR。IR引起B细胞胰岛素分泌负荷加重,长期代偿性胰岛素过渡分泌损害了B细胞的自身结构,这可能与其细胞核及细胞器的病理改变有关[7]。另一方面又可通过改变FFAs及葡萄糖代谢过程中关键酶的活性或表达水平,经葡萄糖-FFA循环抑制葡萄糖刺激的Ins分泌、抑制前胰岛素原启动子的合成速率及mRNA表达、使葡萄糖转运子-2表达降低,B细胞凋亡异常增加等引起B细胞结构损害及功能缺陷。此外,FFA水平长期升高,使三酰甘油(TG)产生堆积。TG在肝脏和肌肉中沉积可引起IR,在B细胞中沉积则可导致B细胞的结构异常而凋亡。其三,胰岛淀粉样多肽(IAPP)的过度沉积会影响B细胞结构,引起B细胞凋亡。Clark等[8]对死亡的15例2型糖尿病患者和10例年龄相配对照者的胰腺组织进行免疫过氧化物酶染色。发现其中13例2型糖尿病患者在胰体部(包括胰体、胰尾和胰头的前部)有淀粉样物沉积,而对照组均无。Janson等[9]研究发现,小的、新形成成熟的IAPP聚集物,对胰岛细胞有“细胞毒作用”。小的IAPP聚集物通过其疏水区与细胞膜相互作用,破坏了膜的稳定性,导致细胞凋亡或死亡。而一旦IAPP成熟,聚集物体积增大,包含分子数目>106,其疏水区局限于沉积物内部,便不能与细胞膜相互作用,因而不具有毒性作用。Janciauskiene等[10]通过研究发现IAPP还可能通过影响胰岛素产生细胞氧化机制和脂蛋白摄取产生细胞毒效应。
         
  总之,引起B细胞结构破坏的因素很多,有遗传因素,也有环境因素,引起B细胞结构破坏的发生机制也多种多样,是综合作用的结果,其详细机制有待进一步研究。B细胞结构损害是其功能缺陷的形态基础。B细胞功能缺陷会导致血糖升高,引发糖尿病,是T2DM发病的一个重要因素,在T2DM的发病过程中发挥着重要作用。
参考文献
    [1] Finegood DT,McArthur MD,Kojwang D,et al.Beta-cell mass dynamics in Zucker diabetic fatty rats.Rosiglitazone prevents the rise in net cell death. Diabetes,2001,50:1 021~1 029.

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  [4] 翁孝刚.2型糖尿病与胰岛b-细胞功能.新乡医学院学报,2002,19(3):231.

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  [6] Jonas JC,Sharma A,Hasenkamp W,et al.Chronic hyperglycemia triggers loss of pancreatic β-cell differentiation in an animal model of diabetes[J].Biol Chem,1999,274(24):14 112~14 121.

  [7] Bar-On H, Ben-Sasson,Ziv E,et al.Irreversibility of nutritionally induced NIDDM in psammomys obesus is related to beta-cell apoptosis .Pancreas,1999,18:259~265.

  [8] Clark A,Wells CA,Buley ID,et al.Islet amyloid,increased A-cells,reduced B-cell and exocrine fibrosis:quantitative changes in the pancreas in type 2 diabetes .Diabetes Res,1988,9(4):151~159.

  [9] Janson J,Ashley RH,Harrison D,et al.The mechanism of islet amyloid polypeptide toxicity is membrane disruption by intermediate-sized toxic amyloid particles .Diabetes,1999,48:491~498.

  [10] Janciauskiene S,Ahren B.Fibrillar islet amyloid polypeptide differentially affects oxidative mechanisms and lipoprotein uptake in correlation with cytotoxicity in two insulin-producing cell lines. Biochem Biophys Res Commun,2000,267:619~625.
作者:张旭东

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